Глава 19

Генетическая трансформация

Индуцированные наследственные изменения классической генетики — мутации, вызываемые высокочастотным излучением и мутагенными веществами, — «случайны», т. е. ненаправленны. Тот или иной мутагенный фактор индуцирует разнообразные мутации в разных локусах. Индуцирование направленных наследственных изменений было предметом спекуляций в классической генетике и в эволюционной генетике начального периода. Направленные наследственные изменения рассматривались в то время как интересная возможность, связанная с переносом специфичного генетического материала из одного организма в другой и его включением в клетки зародышевой линии организма-реципиента. В третьем издании книги Добржанского «Генетика и происхождение видов» есть специальный раздел «В поисках направленного мутационного процесса» (Dobzhansky, 1951*).

Первые работы по индуцированию направленных наследственных изменений проводились вне рамок генетических исследований. Генетическое значение ранних работ по трансформации у Pneumococcus не сразу было оценено должным образом. Однако в конце концов они получили широкое признание, и были сделаны попытки индуцировать направленные изменения у высших животных. Вначале результаты были разноречивыми, но сравнительно недавно, после многих неудач, возможность получения направленных наследственных изменений у высших животных была установлена экспериментально. В настоящее время работы в этой области развиваются в направлении практической генной инженерии.

Мы примем здесь широко используемый термин «генетическая трансформация» для обозначения направленного генетического изменения, возникающего в результате переноса генетического материала организма-донора организму-реципиенту. Другие обычно используемые синонимические термины — перенос гена и наследственная индукция.

Синтетическая теория эволюции не уделила должного внимания эволюционной роли генетической трансформации. Согласно этой теории, отправной точкой эволюции служит ненаправленная мутационная изменчивость. Направленные генетические изменения не укладываются в эту теорию. Такие изменения, однако, действительно происходят, хотя мы до сих пор не знаем, насколько велика их роль в эволюции, и синтетической теории придется сообразоваться с ними.

Трансформация и трансдукция у бактерий

Первый заслуживающий доверия случай наследственного изменения, возникшего в результате приобретения чужеродного генетического материала, был обнаружен у бактерии Pneumococcus — возбудителя пневмонии. Трансформация у Pneumococcus была открыта Гриффитом (Griffith) в 1928 г., а в 1944 г. Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти (Avery, MacLeod, McCarty)* получили её in vitro. Все основные факты, связанные с этими открытиями, в настоящее время широко известны и будут здесь изложены кратко. Штаммы Pneumococcus различаются по свойствам клеточной поверхности, которая может быть гладкой или шероховатой, и степени вирулентности, связанной с типом поверхности. Эти различия наследуются. Если выращивать один штамм бактерий на стерильном экстракте, содержащем ДНК другого штамма, то некоторые дочерние клетки первого штамма приобретают свойства клеточной поверхности и вирулентность, характерные для второго штамма. Эти изменения передаются по наследству. Наследственные признаки штамма-донора передаются штамму-реципиенту через ДНК донора в стерильной ростовой среде (Avery et al., 1944*).

Наследственные трансформации, вызываемые стерильными экстрактами, обнаружены и у бактерий других родов (Hemophilus и Streptococcus) и по другим признакам — по устойчивости к пенициллину и стрептомицину*.

Трансформация у бактерий — явление, наблюдаемое в лаборатории. Её природный аналог — это трансдукция. Бактериальные вирусы, или фаги, в природных условиях иногда переносят генетический материал из одной бактериальной клетки в другую. Такой перенос бактериального генетического материала фагами называют трансдукцией.

Процесс трансдукции протекает следующим образом. Фаг заражает одну бактериальную клетку и размножается в ней за счет ДНК хозяина. Затем одна из дочерних фаговых частиц заражает другую бактериальную клетку и вносит при этом генетический материал первой клетки-хозяина во вторую клетку-хозяина. Наиболее успешно трансдукцию осуществляют умеренные фаги, которые не вызывают полного разрушения бактерий-хозяев. Трансдуцированные бактерии продолжают при этом свое существование и воспроизводят свои измененные признаки.

Установлено, что трансдукция происходит у бактерий таких родов, как Salmonella, Escherichia, Pseudomonas, Staphylococcus и некоторых других. К числу признаков, передаваемых путем трансдукции, относятся способность к синтезу тех или иных веществ, устойчивость к антибиотикам и подвижность (см. Hayes, 1968, гл. 21*). В одном случае конверсии у Clostridium изменяется тип токсина, вырабатываемого бактерией. Один из штаммов Clostridium botulinum, который обычно вызывает ботулизм у человека и животных, при заражении определённым фагом превращается в другой штамм Clostridium, вызывающий газовую гангрену (Eklund et al., 1974*).

Экспериментальная трансформация у животных

Одно из первых исследований трансформации у высших животных касалось мозаицизма тела у Drosophila melanogaster. Яйца, содержащие зародыши D. melanogaster дикого типа на ранних стадиях развития, обрабатывали раствором, содержащим ДНК мух со специфическими мутантными признаками. В качестве генетических маркеров использовали мутации, изменяющие пигментацию тела, форму щетинок и окраску глаз. Из обработанных таким образом зародышей развивались взрослые мухи, обладавшие тем же фенотипическим признаком, что и мутантный штамм, служивший донором трансформирующей ДНК. Более того, трансформированные признаки оказались наследственными. Однако трансформированные особи были мозаичными, т. е. участки мутантной ткани чередовались с нормальными; полной трансформации всего тела или какой-то его части не наблюдалось (Fox, Yoon, 1966; 1970*).

Косвенные данные позволяют считать, что трансформирующая ДНК не включается в хромосомы мух-реципиентов. Вероятно, в некоторых клеточных линиях или секторах трансформирующая ДНК попадает в какие-то другие части клетки. Такое распределение позволило бы объяснить мозаичность фенотипических эффектов (Fox et al., 1970; 1971*).

В недавних экспериментах по трансформации у D. melanogaster в качестве маркера был использован ген rosy, детерминирующий розовый цвет глаз, а в качестве вектора — транспозон (Р). Элемент Р несёт хромосомный участок, в котором находится ген rosy; в описываемом эксперименте элемент Р содержал аллель дикого типа гена rosy. Элемент Р может встраиваться в различные сайты любой хромосомы комплемента. Он может проникнуть как в клетки зародышевой линии, так и в соматические ткани. Зародышам мутантных мух с глазами rosy вводили транспозоны, несущие аллель дикого типа. У потомков этих мух глаза имели нормальную окраску (Rubin, Spradling, 1982*).

В различных лабораториях в настоящее время индуцируют трансформации у мышей. Чужеродную ДНК, содержащую определённые гены-маркеры, вводят в оплодотворенные яйцеклетки мышей, а затем имплантируют их в другую самку. Исследователей прежде всего интересовало, проявится ли чужеродный ген(ы) фенотипически у развивающихся из этих яйцеклеток мышей. Иногда такие гены проявлялись, а иногда нет. Следующим вопросом было, включится ли индуцированный ген(ы) в клетки зародышевой линии и будет ли он передан следующему поколению. Опять-таки иногда такая передача происходила, а иногда нет (Gordon et al., 1980; краткие обзоры см. Marx, 1981, 1982a, b*).

В одном очень интересном эксперименте ген крысы, детерминирующий гормон роста, был перенесен методом сплайсинга в участок мышиной ДНК, который затем ввели в мышиные яйцеклетки. Крысиный ген включился в ткани одной трети мышей, развившихся из обработанных таким образом яиц, и проявился фенотипически в увеличении размеров тела; трансформированные мыши весили вдвое больше по сравнению с особями из необработанных пометов (Palmiter et al., 1982*).

С помощью другого метода трансформация была экспериментально индуцирована у кур (Pandey, Patchell, 1982*). Перенос желательных чужеродных генов домашним животным стал теперь обычным делом в животноводстве (Marx, 1988*).

Гибридная стерильность у Drosophila paulistorum

Drosophita paulistorum — группа видов, состоящая из ряда зарождающихся видов или полувидов, обитающих в Центральной и Южной Америке. Гибриды между некоторыми из этих полувидов стерильны. Скрещивания между другими полувидами дают стерильных гибридных самцов. При иных скрещиваниях всё потомство оказывается плодовитым. Мужская стерильность в тех случаях, когда она существует, частично определяется факторами, которые передаются через цитоплазму яйца. В конечном счете мужская стерильность гибридов обусловлена взаимодействием между этими цитоплазматическими факторами и хромосомами.

Предрасположенность к стерильности, таким образом, передается самками мух с определённой цитоплазматической конституцией их гибридным потомкам мужского пола. Следовательно, возможно такое положение, когда скрещивание в одном направлении (например, самка Санта-Марта × самец Мезитас) даёт в F1 стерильных самцов, а реципрокное скрещивание (самка Мезитас × самец Сайта-Марта) даёт в F1 фертильных самцов (Ehrman, Williamson, 1965; Williamson, Ehrman, 1967*).

Уильямсон и Эрман (Williamson, Ehrman, 1967*) приготовили гомогенат из цитоплазмы яиц линии Сайта-Марта и ввели этот гомогенат самкам линии Мезитас. Обработанных таким образом самок Мезитас скрестили затем с самцами Сайта-Марта. Обработанные самки Мезитас (в отличие от необработанных самок этой линии) производили стерильных мужских гибридов. Мужская стерильность индуцировалась инъекцией родителю женского пола цитоплазмы особого типа.

Какова природа цитоплазматических факторов, обусловливающих стерильность? На электронных микрофотографиях репродуктивных тканей стерильных самцов выявляется присутствие в цитоплазме частиц, сходных с микоплазмами (Ehrman, Kernaghan, 1971; Daniels, Ehrman, 1974*).

Согласно более поздним данным (Somerson et al., 1984*), мужская стерильность коррелирует с присутствием в клетках L-форм стрептококков.

Вероятная гипотеза, позволяющая объяснить эти разные группы фактов, состоит в том, что в клетках некоторых полувидов группы Drosophila paulistorum живут в качестве симбионтов микоплазмы или подобные им организмы. У этих полувидов хромосомные гены так хорошо «подогнаны» к зараженной цитоплазме, что нормальная плодовитость не нарушается. Однако при скрещиваниях, в которых эти несущие симбионтов полувиды используются в качестве родительской особи женского пола, а не содержащие симбионтов линии — в качестве особи мужского пола, возникают сочетания цитоплазмы и хромосомных генов, «не подогнанные» друг к другу. Фенотипическим проявлением такого взаимодействия между цитоплазмой и ядром является мужская стерильность гибридов (Williamson, Ehrman, 1967; Ehrman, Kernaghan, 1971*).

Экспериментальная трансформация у растений

Попытки экспериментально вызвать генетическую трансформацию у растений до сих пор были либо неудачными, либо давали лишь частично успешные или неубедительные результаты (Kleinhofs, Behki, 1977; Hess, 1977; Сое, Neuffer, 1977; Schiemann, 1982; Barton, Brill, 1983*).

Неожиданные и загадочные результаты были получены в ранних экспериментах со льном (Linum usitatissimum). В исходных поколениях разные растения льна выращивали, внося в почву различные дозы N, Р и К; растения реагировали на разные условия обычным образом, т. е. мощным ростом и высоким урожаем. Эта стандартная фенотипическая реакция не должна была сохраняться в последующих поколениях, выращиваемых в обычных условиях. Однако в данном случае потомки индуцированных крупных растений сохраняли крупные размеры, несмотря на снижение содержания в почве питательных веществ, а потомки индуцированных мелких растений оставались мелкими даже при повышении уровня питательных веществ. Индуцированные различия размеров сохранялись на протяжении 10 поколений. Скрещивания между полученными таким образом крупными и мелкими растениями давали в F1 гибриды промежуточных размеров. Эти наследственные различия размеров, по-видимому, не связаны с цитоплазмой (Durrant, 1962a, b*). В более поздних исследованиях между крупными и мелкими линиями были обнаружены различия в содержании ДНК в ядрах; у потомков индуцированных крупных растений оно было выше (Evans et al., 1966; Timmis, Ingle, 1974*). Воздействие питательных веществ индуцировало изменения в количестве ДНК с повторами; эта ДНК содержит последовательности, кодирующие РНК рибосом, в которых происходит синтез белка (Marx, 1984*).

Сходные индуцированные изменения размеров, связанные с количеством вносимых в почву питательных веществ, наблюдались на протяжении трёх поколений у растений махорки (Nicotiana rustica) (Hill, 1967*).

В экспериментах на Nicotiana, проведенных Пэнди (Pandey, 1976; 1978; 1980*), использовался метод двойного опыления. Женское родительское растение опыляли смесью живой пыльцы одного генетического типа и убитой облучением пыльцы другого типа. Мёртвая пыльца способна прорастать и вводить свою ДНК в зародышевый мешок, но не способна производить оплодотворение. Генетические маркеры, содержащиеся в мертвой пыльце, появляются в некоторых особях F1; их судьба была прослежена На протяжении двух последующих поколений. По-видимому, участки хромосом, несущие гены-маркеры мертвой пыльцы, попадают в ядро яйцеклетки и включаются в него*.

Трансформация в природе

Вопрос о том, происходит ли генетическая трансформация в природе и оказывало ли это сколько-нибудь существенное влияние на эволюцию, представляет большой интерес.

Никаких данных о роли трансдукции в эволюции бактерий неизвестно, хотя само существование процесса трансдукции у бактерий твердо установлено. Вместе с тем известно, что в основе некоторых эволюционных изменений у бактерий лежат такие обычные процессы, как мутагенез и отбор. Например, развитие устойчивости к фагу изначально зависит от спонтанного возникновения в популяциях бактерий мутаций, детерминирующих такую устойчивость. Эти мутации возникают с определённой низкой частотой, на которую не влияет наличие или отсутствие в среде фага. Таким образом, микрозволюционное изменение происходит по ортодоксальной схеме. К отсутствию данных о роли трансдукции в эволюции бактерий не следует, однако, относиться слишком серьезно, поскольку трансдукция изучается главным образом с молекулярной, а не с эволюционной точки зрения.

Условия для естественной трансформации у высших растений могли бы существовать в тех случаях, когда гены переносятся от одного растения к другому с помощью хорошего вектора ДНК, такого, как почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens. Известно, что эта бактерия несёт, помимо всего прочего, фрагменты бактериальной ДНК (плазмиды), которые содержат бактериальные гены, детерминирующие синтез опинов. Опины — это производные аминокислот, обычно не вырабатываемые растениями, но служащие питательными веществами для бактерий. Заражая растение, Agrobacterium вводит плазмиду, содержащую бактериальные опинсинтезирующие гены, в ядерную ДНК растения-хозяина, где они функционируют. Бактерия трансформирует клетки хозяина с помощью своего собственного генетического материала благоприятным для себя образом; нетрудно представить, однако, что она может переносить в растение-хозяина и генетический материал от других организмов (Barton, Brill, 1983*).

В корневых клубеньках некоторых бобовых растений содержится особый глобин — леггемоглобин, участвующий в фиксации азота. Леггемоглобин сходен с гемоглобином позвоночных. Высказывалось мнение, что глобин был перенесен в растения от животных какой-то бактерией или вирусом, которые в свою очередь были перенесены насекомыми (Lewin, 1981*). Однако Диллон (Dillon, 1983*) полагает, что гомологии между леггемоглобинами и глобинами слишком сложны, чтобы их можно было объяснить простым переносом гена.

Гены вирусов С-типа могут попасть в хромосомную ДНК млекопитающих, включиться в нее и начать функционировать, продуцируя вирусные частицы. Они проникают также в клетки зародышевого пути и передаются через гаметы. Один из генов вирусов С-типа, для которого характерна особая последовательность нуклеотидов, встречается у низших и высших узконосых обезьян. Интересно отметить, что близкий к нему ген со сходной нуклеотидной последовательностью обнаружен у домашних кошек и других видов кошачьих в Средиземноморской области, но не у кошек других континентальных областей. Такое перекрывание географического распространения двух близких форм вируса объясняется, возможно, переносом генов — с помощью вирусов и их переносчиков — от обезьян кошкам в Средиземноморской области (Benveniste, Todaro, 1974*).

Согласно теории эндосимбиоза (Margulis, 1970; 1981*), митохондрии эукариот и хлоропласты растений и зеленых жгутиковых произошли от свободноживущих прокариот, заселивших примитивные эукариотические клетки и оставшихся в цитоплазме в качестве постоянных самовоспроизводящихся симбионтов. Считается, что митохондрии происходят от аэробных бактерий, а хлоропласты — от синезеленых водорослей. Основанием для этой теории служит структурное и биохимическое сходство между этими органеллами и соответствующими формами современных прокариот. Митохондрии содержат кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, сходной с ДНК бактерий. Хлоропласты, так же как и клетки синезеленых водорослей, окружены мембраной, содержат фотосинтетический аппарат и, помимо ДНК, тельца, похожие на рибосомы. Кроме того, синезеленые водоросли часто вступают в симбиоз с различными эукариотическими организмами.

Данные в пользу эндосимбиотической теории происхождения клеточных органелл убедительны, но её нельзя считать абсолютно доказанной. К сторонникам этой теории принадлежат Маргелис (Margulis, 1970; 1981*), Равен (Raven, 1970*), Рис и Плаут (Ris, Plaut, 1962*) и Партье (Parthier, 1982*); критические замечания высказали Уззелл и Спольски (Uzzell, Spolsky, 1974*) и Диллон (Dillon, 1981*). Трудность состоит в том, чтобы решить, обусловлены ли черты сходства между органеллами клетки и названными выше прокариотами общим происхождением или конвергенцией.

Следует рассмотреть точки зрения, промежуточные между полным принятием эндосимбиотической теории и полным её отрицанием. Возможно, что хлорапласты действительно были когда-то эндосимбионтами, но митохондрии не ведут свое происхождение от прокариот (Parthier, 1982*).

Если эндосимбиотическая теория верна хотя бы частично, она должна быть веским доводом в пользу представления о важной эволюционной роли необычных способов переноса генов. Приобретение примитивными эукариотами эндосимбиотических синезеленых водорослей могло быть решающим шагом в эволюции, открывшим возможность развития зеленых жгутиковых и царства растений.

Обесцвечивание у Euglena

Еще одним примером индуцированного и направленного наследственного изменения служит явление обесцвечивания у зеленого жгутикового Euglena. Обесцвечивание обусловлено перманентной утратой хлоропластов определённой клеточной линией.

Зеленая окраска эвглены создаётся фотосннтезирующим пигментом хлорофиллом, который находится в хлоропластах. Хлоропласты представляют собой ДНК-содержащие и обычно самово­спроизво­дящиеся органеллы, находящиеся в цитоплазме; их гены относятся к цитоплазматическим. Для нормального развития и функционирования зеленых хлоропластов необходимы свет и другие факторы,

Euglena gracilis, которая на свету сама синтезирует сахар, можно выращивать в темноте на искусственной среде, содержащей сахар. В темноте хлорофилл не образуется, а впоследствии может нарушиться и воспроизведение самих пластид, число которых постепенно сокращается, пока в конце концов они не исчезают вовсе у всех клеток данной линии. Эта потеря носит перманентный характер. Культура Euglena gracilis, утратившая хлоропласты в результате содержания в темноте, не может восстановить их, если её вновь перенести на свет (см. Lewin, 1962*).

Обесцвечивание у Euglena gracilis может вызываться, помимо темноты, и другими внешними факторами, в частности высокой температурой (32—35°С), облучением ультрафиолетом и действием антибиотиков, например стрептомицина и т. п. (Lewin, 1962*).

Под влиянием таких факторов среды зеленая фотосинтезирующая линия Euglena может превратиться в бесцветный гетеротрофный штамм, способный расти только на среде, содержащей сахар. Производный штамм Euglena морфологически сходен с бесцветным эвгленоидом Astasia longa. Согласно одной из гипотез, касающейся филогении жгутиковых, лишенные окраски эвгленоиды возникли от зеленых эвглен в результате обесцвечивания (Lewin, 1962*).

Обсуждение

Синтетическая теория эволюции следовала классической генетике, подчеркивая роль хромосомных генов. Поведение хромосомных генов у организмов с половым размножением, соответствующее законам Менделя, — основа закона Харди—Вайнберга, правил рекомбинационной изменчивости, генетической теории отбора и других аспектов этой теории. Такое подчеркивание вполне уместно.

Примем в качестве исходного допущения, что приобретение чужеродного генетического материала иногда благоприятно для данного организма или для его потомков. Эукариотические организмы обладают вполне четким механизмом для комбинирования генетического материала из различных источников. Этот механизм— половое размножение, точный и упорядоченный процесс, происходящий обычно в видовой популяции. Следует отметить, что упорядоченность полового процесса имеет отношение исключительно к хромосомным генам.

Кроме того, для развития сложных признаков эукариотических организмов необходимо действие хорошо интегрированных генных систем. Такие генные системы могут компоноваться, поддерживаться и точно настраиваться в данном хромосомном наборе. Сборка и тонкая настройка хромосомного генотипа осуществляются с помощью упорядоченного полового процесса. Неупорядоченное, производимое методом проб и ошибок комбинирование генетического материала из неродственных источников здесь непригодно.

Этим объясняется вполне оправданное подчеркивание в синтетической теории эволюции значения хромосомных генов и их рекомбинации по строгим правилам, обеспечиваемой половым механизмом. После всего сказанного остается, однако, фактом, что обмен генетическим материалом по методу проб и ошибок также существует. Чужеродный генетический материал из неродственного источника иногда остается более или менее постоянно в цитоплазме эукариотического хозяина, в его ядре, но вне хромосом, или же в каком-нибудь участке одной из хромосом и вносит вклад в наследственную изменчивость этого организма хозяина.

«Нестандартные» способы трансспецифичного обмена генетическим материалом, возможно, представляют собой издавна существующие процессы, которые хорошо действовали на прокариотической стадии эволюционной истории и продолжают играть вспомогательную роль в эволюции эукариот. Половое размножение, эволюция которого протекала параллельно с эволюцией эукариотических организмов, могло вытеснять нестандартные парасексуальные способы обмена генетическим материалом у прокариот вследствие неадекватности этих более примитивных и неэффективных способов, проявившейся после достижения организмами определённого уровня сложности.

Расширенная синтетическая теория эволюции должна распространяться как на обмен генами, происходящий при половом размножении, так и на нерегулярный трансспецифичный перенос генов.